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人工血管吻合口内膜增生性再狭窄动物模型的建立

人工血管吻合口内膜增生性再狭窄动物模型的建立

作者:袁链 莫爵飞 张小明 李艳奎 赵克强    作者单位:100053 北京市,中国中医科学院广安门医院外科;北京大学人民医院血管外科


【摘要】    目的 建立人工血管旁路移植术后吻合口内膜增生性再狭窄的动物模型,为探索抑制人工血管吻合口内膜增生的有效方法做准备。方法 取北京地区大型杂种犬6只,全麻后行双侧髂股动脉人工血管旁路移植术,并结扎、切断人工血管桥之间的自体动脉。随机分为3组,每组2只,分别于术后4周、8周及12周取标本,对两侧人工血管远近端吻合口进行肉眼、病理组织学、免疫组织化学及电子显微镜观察,了解吻合口内膜增生情况。结果 术后4周吻合口即可长出肉眼可见的新生内膜,8周时新生内膜明显增厚,术后12周3根人工血管完全闭塞,远近端吻合口充满增生内膜,另一根仍通畅,整根人工血管覆盖一层完整内膜,吻合口处内膜明显增厚。光镜下可见新生内膜中细胞以梭形细胞为主,在肉眼所见为完全闭塞的吻合口中光学显微镜下在吻合口中部仍可见细小管腔,其内可见血栓。免疫组化及电镜检查均证实新生内膜中细胞主要为平滑肌细胞,电镜检查证实内膜中基质为胶原纤维。结论 对于大型犬,可作为抑制人工血管吻合口内膜增生新疗法的观察时间。新生内膜中细胞以平滑肌细胞为主,基质为胶原纤维,表明已成功建立了人工血管旁路移植术后吻合口内膜增生性再狭窄的动物模型。术后12周增生内膜即可完全堵塞吻合口,是导致人工血管中远期闭塞的主要原因。

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【关键词】

人工血管;吻合口;内膜增生;平滑肌细胞

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动脉粥样硬化是一种累及大中动脉的全身性病变,发生在中老年人下肢的动脉硬化性闭塞是血管外科的常见多发病之一。其严重后果早已被人们认识,根据病变的严重程度和发展的不同阶段患者的症状可以表现为间歇性跛行、持续性剧烈静息痛和肢体远端坏死,最终往往需截肢。通过自体大隐静脉或人工血管旁路移植(vascular graft bypass,VGB)跨越闭塞段,重建血液流入道是目前治疗下肢动脉硬化性闭塞的主要手段之一,尤其是对于长段闭塞无法进行介入治疗的患者。但是据文献报道,VGB后人工血管(vascular graft,VG)的远期通畅率不足50%,自体大隐静脉的远期通畅率也只有70%左右,术后3~6个月内有20%~40%的患者发生再狭窄,其远期通畅率低的共同原因为发生在吻合口的内膜增生导致的再狭窄[1-3]。自体大隐静脉旁路移植的远期通畅率虽高于VGB,但往往由于各种原因无法利用自体大隐静脉。因此,VGB日益成为治疗下肢动脉硬化性闭塞的主要手段。近年来,我们对探索抑制VG自体动脉吻合口内膜增生的有效方法,解决VG远期通畅率低的难题进行了不懈的努力。首先建立了周围动脉VGB后吻合口内膜增生性再狭窄的动物模型。

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1 材料与方法

1.1  实验动物及分组

  取北京地区健康杂种犬6只,雌雄不限,体重15~20 kg,随机分为3组,每组2只。

  1.2  双侧髂股动脉人工血管旁路移植术

  麻醉采取肌内注射速眠新诱导,皮下注射或静脉注射5%戊巴比妥维持。麻醉满意后,取双侧腹股沟弧形切口,游离显露双侧髂股动脉。全身肝素化后,行双侧髂股动脉VGB术,VG采用德国贝朗公司生产的6 mm直径膨体聚四氟乙烯(ePTFE)VG,应用60聚丙烯无创线(美国强生公司生产)进行VG自体动脉端侧吻合。术中保证两近端吻合口处于同一水平,大小一致;两远端吻合口处于同一水平,大小一致。VG均长6 cm,两端均裁剪成45°。吻合完成后结扎、切断人工血管桥之间的自体动脉。术中均静点利复星200 mg。术后送回专门的实验动物养殖场饲养。术后均追加肝素2 500 U,并给予氧氟沙星100 mg,2次/d,口服1周,阿司匹林40 mg,1次/d,口服至取标本。

  1.3  标本取材

  3组实验犬分别于术后4、8周及12周取标本,麻醉同前。游离出双侧VG,取出两侧包括远近端吻合口在内的VG。两侧VG远近端均沿吻合口平面切开,观察内膜增生情况,距两端吻合口各0.5 cm沿平行吻合口平面截取两端VG送病理及电镜检查。病理标本置10%的甲醛溶液中固定,电镜标本置3%戊二醛溶液中固定。

  1.4  组织切片和光镜、电镜检查

  在各标本上取近吻合口1 mm处于吻合口平行的组织切片,进行常规HE染色和αactin免疫组织化学染色,电镜标本进行相应处理,最后分别在光镜和电镜下观察新生内膜的组织结构。

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2 结果

术后4周吻合口即可长出肉眼可见的新生内膜,VG均通畅(图1)。8周时新生内膜明显增厚,VG尚通畅(图2)。术后12周4根VG中3根完全闭塞,远近端吻合口充满增生内膜(图3),另一根VG尚通畅(图4),整根VG覆盖一层完整内膜,吻合口处内膜明显增厚。光镜下可见新生内膜中细胞以梭形细胞为主,愈近管腔侧细胞愈密集(图5)。在肉眼所见为完全闭塞的吻合口中光学显微镜下在吻合口中部仍可见细小管腔,其内可见血栓(图6)。新生内膜中梭形细胞αactin免疫组化染色胞质呈强阳性,证实为血管平滑肌细胞(图7)。透射电镜检查可见新生内膜中细胞具有典型的血管平滑肌细胞的特点,细胞呈梭形,胞质染色均匀一致,其内可见大量细肌丝,胞质中可见肌丝形成的密体,近细胞膜处可见密斑,细胞器主要集中在细胞核周围,可见大量线粒体及内质网(图8)。基质为规则密集排列的胶原纤维(图9)。扫描电镜可见新生内膜腔面覆盖一层内皮细胞(图10),并可见大量红细胞、白细胞、血小板及纤维素等多种血液成分粘附于内膜表面。

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3 讨论

在远端流出道通畅的情况下,周围动脉VGB后VG中远期闭塞的主要原因为吻合口内膜增生导致的再狭窄和继发血栓形成。移植物可以选择自体大隐静脉或VG,但大隐静脉有时无法利用。由于动脉粥样硬化是累及大中动脉的全身性病变,部分患者在接受VGB以前已行冠状动脉自体大隐静脉旁路移植术,部分患者因双侧大隐静脉曲张已行双侧大隐静脉高位结扎剥脱术,这些患者已无大隐静脉或无足够长度的大隐静脉可取。此外,大隐静脉旁路移植术后由吻合口内膜增生导致的移植物闭塞一般无法再通,而VGB后吻合口内膜增生性闭塞后仍有再次手术再通的机会,可与近吻合口部切开VG,切除增生内膜并取出VG内血栓。再者,下肢动脉硬化性闭塞的患者往往伴有冠心病,应用VG进行旁路移植,可将宝贵的自体大隐静脉留于日后更加重要的冠状动脉旁路移植。基于上述原因,我们对抑制VGB后吻合口内膜增生的有效方法进行了探索,首先建立了VGB后吻合口内膜增生性再狭窄的动物模型。

    ePTFE人工血管是周围动脉旁路移植最常使用的人工材料,具有良好的组织相容性和抗感染性。一般来说,植入体内的各种人工材料一旦感染即意味着手术失败,因为感染以后人工材料即成为异物,必须从体内取出切口才能愈合。笔者在临床上曾遇到2例下肢动脉VGB后合并感染的患者,均伴有糖尿病,术后切口有脓血渗出,敞开后可见人工血管暴露于创面。但是经敞开引流,局部应用抗生素,积极控制糖尿病和改善患者营养状况及换药至创面整洁、肉芽新鲜后及时二期缝合切口,2例切口均良好愈合。本实验标本在光镜下可见人工血管壁的微孔内有大量组织细胞长入,这与我们在临床上经常见到的人工血管植入后数周即与周围组织紧密结合、融为一体相一致。由此可见,ePTFE人工血管具有良好的组织相容性及抗感染性,是周围动脉旁路移植的理想材料。

    本动物实验采用体重15~20 kg的大型杂种犬,目的是为了获得口径较粗的髂股动脉。其髂股动脉口径可达4 mm左右,相当于人类膝下动脉的口径,故适合应用直径为6 mm的ePTFE VG(临床上最细的ePTFE VG)进行旁路移植,即进行端侧吻合时其口径和自体动脉的口径相匹配。同时,与小动物相比,大型犬的遗传基因与人类更接近,因此,将实验结果类推到人类将更具有科学性。

    VGB后吻合口新生内膜生长迅速,4周后即长出肉眼可见的内膜,8周后新生内膜明显增厚,12周时部分VG吻合口已充满增生内膜,导致VG完全闭塞。由此可见,吻合口内膜增生是导致本实验中VG中远期闭塞的主要原因,与既往文献报道一致[4-6]。在肉眼所见为完全闭塞的吻合口中,光镜下在增生内膜中央仍可见细小管腔,其内可见陈旧血栓,且增生内膜的组织结构与术后4周吻合口新生内膜的组织结构一致,可见吻合口闭塞并非由吻合口血栓形成以后机化而来,而是由于内膜增生所致。光镜下可见新生内膜中细胞丰富,以梭形细胞为主,免疫组化及透射电镜检查均证实梭形细胞为血管平滑肌细胞,与既往文献报道一致[7-9],证明已成功建立了VG吻合口内膜增生性再狭窄的动物模型,为下一步探索抑制VGB后吻合口内膜增生的新方法奠定了基础。

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【参考文献】

1 孙晋津,陈剑秋.反义碱性成纤维细胞生长因子对血管平滑肌细胞增值的抑制作用.中华实验外科杂志,2004,21:11231125.

  2 刘翠平,罗艳丽,刘素霞.LP(a)、Hcy、HSCRP联合检测在老年下肢动粥样硬化中的临床意义.河北医药,2008,30:436437.

  3 Deuel TF,Bianchi C,Cantley L.Restenosis injury:A problem in regulation of growth.In:Chien KR,Molecular Basis of Cardiovascular Disease.1st ed.Philadelphia.Saunders Company,1999,367391.

  4 Grondin CM,Campeau L,Thornton JC,et al.Coronary artery bypass grafting with saphenous vein.Circulation,1989,79:24.

  5 Clowes W,Reidy A,Wash S.Prevention of stenosis after vascular reconstruction. J Vascular Surg,1991,1385.

  6 汪忠镐,Hagen PO,Milat EM,等.小管径人工血管邻接猴主动脉内膜增生与抗血小板疗法的抑制作用.中华外科杂志,1983,21:705.

  7 景在平,熊江.动脉疾病实验研究进展.中国现代普通外科进展,2002,5:193196.

  8 Davies AH,Magee TR,Sheffield E,et al.The aetiology of vein graft stenosis.Eur J Vasc Surg,1994,8:3891.

  9 Clowes AW,Schwartz SM.Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery.Circ Res,1985,56:139.

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